Đồng chí Nguyễn Thị Định sinh ngày 13/2/1920, ở xã Lương Hòa, huyện Giồng Trôm, tỉnh Bến Tre. 16 tuổi, bà giác ngộ và bắt đầu tham gia cách mạng, đảm nhận nhiệm vụ giao liên, rải truyền đơn và vận động quần chúng đấu tranh. Tháng 10/1938, bà được kết nạp vào Đảng Cộng sản Đông Dương (nay là Đảng Cộng sản Việt Nam).
Năm 1940, chồng đồng chí Nguyễn Thị Định bị địch bắt đày đi Côn Đảo và hy sinh ở đó. Nửa năm sau, đồng chí cũng bị bắt, đi đày Bà Rá (thuộc tỉnh Bình Phước ngày nay). Năm 1943, do bị đau tim nặng,đồng chí được trở về quê, chịu sự quản thúc của chính quyền địa phương. Năm 1944, đồng chí bắt liên lạc được với tổ chức cách mạng rồi tiếp tục hoạt động. Tháng 8/1945, bà tham gia khởi nghĩa giành chính quyền ở Bến Tre. Tháng 3/1946, trong khi đang giữ cương vị Ủy viên Ban Chấp hành Hội Phụ nữ cứu quốc tỉnh, đồng chí Nguyễn Thị Định nhận được lệnh của Khu ủy Khu 8 và Tỉnh ủy Bến Tre, cùng đoàn đại biểu quân - dân – chính – đảng Khu 8 đi bằng đường biển ra Trung ương với 2 nhiệm vụ chính: Báo cáo tình hình cách mạng miền Nam và xin chi viện vũ khí cho quân dân Nam Bộ đánh Pháp. Tháng 11 năm đó, đồng chí làm Trưởng đoàn của đoàn thuyền chở vũ khí về Nam. Bằng lòng quả cảm, trí thông minh, Nguyễn Thị Định cùng các thành viên trong đoàn đã vượt trùng dương, bão tố, khéo léo tránh được hệ thống tuần tra nghiêm ngặt của quân địch, đưa con thuyền chở 12 tấn vũ khí chi viện trở về miền Nam an toàn. Chuyến vượt biển ra Bắc thành công của người thuyền trưởng Nguyễn Thị Định là tiền đề góp phần để Trung ương có cơ sở nghiên cứu, đánh giá, đi tới quyết định thành lập tuyến đường Hồ Chí Minh trên biển huyền thoại sau này. Năm 1947, đồng chí được bầu vào Tỉnh ủy Bến Tre. Từ đó, đồng chí cùng các cán bộ lãnh đạo ở địa phương tổ chức cuộc kháng chiến của nhân dân Bến Tre. Năm 1954, cuộc kháng chiến của nhân dân Bến Tre cùng với cả nước đã giành được thắng lợi.
Sau Hiệp định Giơnevơ, Bến Tre là một trọng điểm bình định của chính quyền tay sai Ngô Đình Diệm, bà đã cùng với các cán bộ lãnh đạo khác của Đảng bộ Bến Tre ra sức bảo vệ thành quả cách mạng, bảo vệ nhân dân, chống địch bình định. Chính quyền Ngô Đình Diệm đã truy tìm quyết liệt, chúng còn treo giải thưởng cho ai bắt được bà. Nhưng chúng đã không làm gì được bà, vì bà luôn thay hình đổi dạng, có lúc giả làm thầy tu, thương buôn, lúc làm nông dân… và luôn được sự đùm bọc của những gia đình cơ sở cách mạng, của những người mẹ, người chị để qua mắt kẻ địch. Dưới sự lãnh đạo của bà và tập thể tỉnh ủy, phong trào Đồng khởi Bến Tre giành thắng lợi (17/1/1960), trở thành biểu tượng kháng chiến kiên cường bất khuất, tiêu biểu cho phong trào cách mạng miền Nam, chuyển từ thế phòng ngự, bảo toàn lực lượng, sang thế tấn công, dẫn đến thắng lợi hoàn toàn. Sau cuộc Đồng khởi Bến Tre, bà làm Bí thư tỉnh ủy và Chủ tịch Mặt trận Giải phóng tỉnh Bến Tre.
Năm 1964, trong Đại hội dân tộc giải phóng miền Nam lần thứ nhất, bà được bầu làm Ủy viên Chủ tịch đoàn Ủy ban Trung ương mặt trận. Năm 1965, bà giữ chức Phó Tư lệnh quân Giải phóng miền Nam; tại đại hội Phụ nữ toàn miền Nam, bà làm Hội trưởng Hội Liên hiệp Phụ nữ Giải phóng miền Nam. Trong suốt những năm tháng kháng chiến chống Mỹ, cứu nước, bà đã cùng Bộ Chỉ huy miền Nam gắn bó với nhân dân, đưa cách mạng miền Nam đi từ thắng lợi này đến thắng lợi khác, góp công giải phóng miền Nam, thống nhất đất nước. Với những đóng góp to lớn đó, tháng 4/1974, Nguyễn Thị Định được phong quân hàm Thiếu tướng và trở thành nữ tướng đầu tiên của Quân đội nhân dân Việt Nam.
Sau ngày miền Nam hoàn toàn giải phóng, bà giữ nhiều chức vụ quan trọng của Đảng và Nhà nước như: Ủy viên Trung ương Đảng khóa IV, V, VI; Đại biểu Quốc hội Việt Nam khóa VI, VII, VIII; Chủ tịch Hội Liên hiệp Phụ nữ Việt Nam. Từ 1987 đến 1992, bà giữ chức Phó Chủ tịch Hội đồng Nhà nước.
Với những chiến công tiêu biểu, bà được tặng thưởng nhiều huân, huy chương như: Huân chương Hồ Chí Minh, Huân chương Quân công hạng Nhất, Huân chương chống Mỹ, cứu nước hạng Nhất, Huân chương Quyết thắng hạng Nhất, Huy hiệu 50 năm tuổi Đảng, Danh hiệu Anh hùng lực lượng vũ trang nhân dân; được nước Cộng hòa dân chủ Lào tặng Huân chương Tự do hạng Nhất; được Liên Xô tặng Giải thưởng Hòa bình Lênin và là người nước ngoài đầu tiên được tặng Huân chương Hữu nghị các dân tộc của Liên Xô; được Đảng và Chính phủ Cuba trao tặng Huân Chương Hiron và nhiều phần thưởng cao quý khác.